石英晶体微天平(Quartz Crystal Microbalance: QCM)

        可以在ng水平上实时定量物质在传感器表面吸附量的方法。通过分析吸附过程，可以计算出分子间相互作用强度的结合常数和相互作用速度的结合速度常数。另外，还销售可以解析吸附物质粘弹性的装置。对象从低分子到蛋白质、核酸、高分子薄膜，只要是有一定质量的物质都可以测定。

       可测量范围：

       分子间相互作用测定/结合（解离）常数/结合（解离）速度常数/薄膜膜厚/表面吸附量/表面吸附物质粘弹性

       质量变化测量原理

       所谓石英晶体，是指在将水晶的结晶切成极薄板状的切片的两侧成膜金属薄膜的结构，如果对各个金属薄膜施加交流电场，则显示出以一定的振动频率（共振振动频率）振动的性质。在金属薄膜上吸附纳米·克左右的物质的话，根据其质量共振频率会减少，所以可以作为微量天平使用。因此，这种方法也被称为QCM（Quartz-Crystal Microbalance：石英晶体微天平）法。

       众所周知，石英晶体有各种各样的振动模式，但QCM法一般使用图1（a）所示的厚度滑动振动（Thickness shear mode）。石英晶体以一定的振动频率持续振荡时，根据水晶板的金属薄膜上存在的物质的质量，如图1（b）所示，振动频率发生变化。20世纪50年代报道了这种频率变化与金电极上物质的质量成正比1）。频率的变化量与附着物质的质量的关系，用被称为Sauerbrey式的式（1）表示。

图1（a）石英晶片的厚度滑动振动的示意图
（b）物质吸附在石英晶片上时的波长变化的示意图

       该公式表明，频率ΔF与质量Δm成正比。另外，可以理解基本振动频率f0越大，ΔF对质量变化的灵敏度越大，灵敏度越高，但由于基本振动频率f0依赖于水晶板的厚度，所以水晶板越薄，对质量变化»m的灵敏度越高。例如，厚度180µm可获得9MHz、60µm可获得27MHz、15µm可获得110MHz的基本频率。通过使用更高基本频率的石英晶体，可以得到更高的信号，但当然环境噪声的影响也变大，而且薄的石英晶体不容易操作，因此一般使用具有5~30MHz左右的基本频率的石英晶体。从式中附有-可知，随着质量增加，振动频率减少。在这里ρq = 2.648 g cm-3、µq=2.947×1011dyn cm-2时，基本频率9MHz的石英晶体的质量灵敏度为5.45ngcm-2Hz-1，基本频率27MHz时的质量灵敏度为0.605ngcm-2Hz-1。

       关于QCM法的测定原理的详细情况，有很多综述，请参照2）3）。

       测量
       在QCM法中，测量方法大致分为2种，是在频率计数器中直接测量共振频率的方法和使用网络分析仪等获得共振点附近的频率特性的方法。前者得到的参数只有共振频率，后者也可以得到共振频率以外的信息（参照后述的粘弹性分析）。
QCM法的特征是可以实时测量。不仅是静态吸附量的定量，还可以动态捕捉吸附过程。这不仅对吸附速度和解离速度的定量有效，还可以详细解析酶反应等吸附和反应连续发生的反应。实时测量的采样率也依赖于使用的装置，但由于是与测量噪声的折衷，因此不适合胡乱使用短采样率，应该根据测量的目的来判断并选择所需的采样率。一般使用0.5～10sec的范围。

       QCM法的一大特征是不选择测定介质，报道了气相中4）、液相中5）6）7）、真空中8）或超临界流体中9）的测定事例。但是，在水溶液中等粘性高的介质中，厚度滑动振动容易衰减，为了实施稳定的测定，传感器构造、电路、温度调节等需要很多技术，因此最好使用考虑到这一点的市售装置。

       分析
       市面上很多测量装置都会实时监测石英晶体的振动频率，通常在测量软件上实时绘制1秒1点的振动频率数据。振动频率减少表示物质在传感器表面的吸附量增加，振动频率上升表示物质在传感器表面的吸附量减少，即物质的解离。在这里想量化生物体内的分子间相互作用的时候，经常被利用的参数之一有离解常数（Kd）和结合常数（Ka）。这个值被用来评价2种分子间相互作用中的亲和性的强度，强的相互作用在生物体内可以说是“容易发生”。
       在QCM的测定中，将想要解析相互作用的分子中的某一个作为主体分子固定在传感器表面，通过在溶液中添加作为客体分子的一个分子，将伴随相互作用的传感器表面的质量的增加作为振动频率变化进行测定。作为例子，考虑进行以下式（2-1）所示的1:1相互作用的A和B的分子的反应。

       此时，解离常数可以用式（2-2）表示，结合常数可以用式（2-3）表示。在此，[A]、[B]及[AB]为相互作用达到平衡时的A、B及复合体AB的浓度。

       解离常数为结合常数的倒数，单位分别为M（解离常数）和M-1（结合常数）。在亲和性非常强的相互作用的情况下，由于复合体AB的浓度变高，所以式（2-2）中的[AB]值变大，Kd变小。也就是说，可以说Kd越小越强的相互作用，越大越弱的相互作用。

图2 是与固定在传感器表面上的分子B结合的分子A的示意图

       在实际实验中，计算各客体分子浓度[A]0时的饱和吸附量ΔF，将其绘制为横轴[A]0、纵轴ΔF。使用公式（2-4）对得到的曲线进行曲线拟合，可以导出Kd和ΔFmax的组合（图3）。

       ΔF=ΔFmax/2时，由式（2-4）变为[A]0=Kd，因此Kd值可以称为表示ΔFmax/2结合量时的溶液中客体分子浓度。

图3 相互作用分析的典型图概念图和吸附量浓度的图

       此外，还有进行相互作用的速度解析10）、酶反应11）、其他因子参与的复杂反应12）、蛋白质凝聚反应13）的解析的事例，详细情况请参照文献。
 
       测试案例

      如前所述，如果吸附在表面上，则可以与该吸附质量成比例地进行检测，因此只要是具有一定质量的物质即可进行测定。一般来说，QCM的传感器表面是金电极，所以也可以测定蛋白质和高分子对金电极的吸附，但是通过真空蒸镀法、溅射法、旋涂法等在电极上形成其他金属14）和金属氧化物15）、高分子薄膜16）之后进行测定的事例也很多。另外，利用金表面和S原子的相互作用，使用烷烃硫醇形成自组装单分子膜（SAM），在表面呈现各种官能团后，固定目标分子的情况也很多。在这种情况下，形成提示羧酸的SAM，与蛋白质的氨基反应而固定化的事例最多17）。另外，也有为了抑制对表面的非特吸附而使用具有乙二醇的表面的事例17）。

       测定对象分子除了蛋白质以外还有核酸18）、糖类19）、高分子层叠膜20）、高分子纳米粒子21、脂质22）等非常多的报告。

       粘弹性分析

       市售的一部分QCM装置不仅有吸附量测定，还有吸附物质的粘弹性解析可能的装置。在石英晶体的共振点附近扫描振动频率，测量导纳，绘制导纳的实数成分即电导，可以得到图4（右）所示的共振曲线。该共振曲线在气相中这样的振动衰减少的介质中是敏锐的曲线，但在水溶液中振动会大幅衰减，成为迟钝的曲线。详细情况请参考文献23）24），从该共振曲线可以得到关于振动质量的Quality factor（或倒数的Dissipation factor）。如果吸附物质是一般的刚性体，在吸附过程中它们的参数不会变化，但是如果吸附物质是粘弹性体，吸附物质中的振动能量损失大，就会发生变化。即，通过测定石英晶体的共振曲线的变化，除了吸附质量之外，还可以测定吸附物质的粘弹性。使用这个原理，进行了蛋白质的粘弹性解析的事例25），表面的聚合物刷子的粘弹性解析的事例26）等多数文献被报告。

图4 石英晶体的导纳圆线图及共振点附近的电导的概念图27）